写于 2017-09-06 12:07:06| 澳门拉斯维加斯线上娱乐| 澳门拉斯维加斯的网址

由Mercier,Marie Le Mathieu,Veronique; Haibe-Kains,Benjamin; Bontempi,Gianluca; Mjatovic,Tatjana; Decaestecker,Christine;吻,罗伯特; Lefranc,佛罗伦萨摘要Galectin(Gal)1是一种缺氧调节的促血管生成因子,也直接参与胶质母细胞瘤细胞迁移为了确定Gal-1如何发挥其促血管生成作用,我们研究了人Hs683胶质母细胞瘤细胞系Galectin 1中的Gal-1信号传导

信号通过内质网跨膜激酶/核糖核酸酶肌醇 - 需要1alpha,调节氧调节蛋白的表达150氧调节蛋白150控制血管内皮生长因子成熟Galectin 1也调节其他7个缺氧相关基因的表达(即与血管生成有关的CTGF,ATF3,PPP1R15A,HSPA5,TRA1和CYR61)通过siRNA给药降低小鼠脑中Hs683原位异种移植物中Gal-1的表达,降低了内质网应激,增强了自养药物替莫唑胺的治疗效果这些结果表明减少Gal-1表达(例如通过大脑传递)非病毒性输注抗Gal-1 siRNA在患者中的表达可代表胶质母细胞瘤的另一种治疗策略关键词:血管生成,内质网应激,半乳糖凝集素1,胶质母细胞瘤,缺氧引言恶性胶质瘤,特别是多形性胶质母细胞瘤(GBM),弥漫性侵入脑组织作为单个迁移细胞,细胞凋亡水平降低,从而对促凋亡药物的细胞毒性作用产生耐药性(1)GBM患者目前的治疗方法包括最大手术切除,然后采用放线疗法和药物替莫唑胺(2)尽管采用积极的治疗方案GBM的预后仍然很差多形性胶质母细胞瘤在坏死和内皮细胞增殖的存在下在病理学上与低级别肿瘤相区别(3)恶性胶质瘤中的坏死灶通常被“伪疟疾”肿瘤细胞的独特构型所包围

这些细胞是严重缺氧,过度劳累ess缺氧诱导因子,并分泌促血管生成因子,如血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素8(3)一个新兴的模型表明,伪疟疾代表了一股肿瘤细胞,它们正在积极地从中心缺氧灶移出

血管损伤的后果(3)半乳糖凝集素(Gal)1属于哺乳动物凝集素家族,对β-半乳糖苷具有特异性(4,5)它影响胶质瘤细胞在体外和体内的迁移(6,7)Galectin 1由肿瘤内皮细胞表达(8-10),它有助于肿瘤进展的不同阶段,如免疫逃逸和转移(11,12)

它在低氧条件下表达增加(13),并发挥有效的促血管生成作用( 9)除了增加Gal-1表达外,缺氧本身也影响血管生成(14,15),包括GBMs在内的实体瘤氧合缺陷(3)与由于chang导致的患者预后不良有关细胞代谢,血管生成,侵袭性和对治疗的抵抗力(16)内皮细胞Gal-1因此是抗癌治疗的潜在靶点(9,10)最近,已经证明缺氧通过调节抑制蛋白质合成

mRNA翻译的起始步骤(17)这似乎是细胞对缺氧反应的共同特征,并且由2种不同的途径介导

第一种快速发生,是短暂的,并且与未折叠蛋白反应(UPR)的激活有关

发生在内质网(ER)应激反应中(17)在这个初始阶段的翻译抑制是由于蛋白激酶样ER激酶(PERK)依赖性方式中真核起始因子2alpha的磷酸化(17-19)由于第二个真核起始复合物(eIF4F)的抑制作用,缺氧过程中瞬时翻译的总体水平仍然很低(17,19)

第二种机制是多因素的,但部分是抑制哺乳动物雷帕霉素激酶靶标的结果(17,19)PERK失活或真核起始因子2alpha磷酸化损害缺氧时细胞存活(18,19) 在这项研究中,我们研究了瞬时损害人Hs683 GBM细胞中Gal-1表达是否可以改变ER应激和/或UPR谱的模式以及这些修饰如何影响肿瘤血管生成我们的数据提供了对胶质母细胞瘤发病机制的见解并提出了新的方法

治疗GBMs材料和方法细胞培养物和化合物Hs683人胶质母细胞瘤细胞系(美国典型培养物保藏中心代码HTB-138)获自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA),并在我们的实验室保存,如前所述(20)从Erasmus Academic Hospital的脐带获得人脐静脉内皮细胞(HUVEC)

通过胶原酶处理分离细胞,并在来自Lonza(Verviers,Belgium)的内皮细胞生长培养基EGM-2 MV bulletkit中生长人脐静脉内皮细胞

第5代和第10代之间使用培养物

替莫唑胺购自Schering Plough(Brussels,Be lsium)Hs683裸鼠中的人GBM原位异种移植物如前所述(20)在每个实验中,进行人Hs683胶质母细胞瘤细胞对裸鼠的体内原位异种移植(8周龄雌性nu / nu小鼠(21-23g; Iffa Credo,Charles River Laboratories,L'Arbresle,France)在同一天立体定向植入Hs683肿瘤细胞

每个实验组包含11只小鼠本研究中描述的所有体内实验均基于授权号LA1230509进行

联邦卫生,营养安全和环境部动物伦理委员会(比利时)Anti-Gal-1 siRNA目前工作中使用的抗Gal-1 siRNA(Eurogentec; Seraing,比利时)的有义序列是5 '-GCUGCCAGAUGGAUACGAADTDT-3',反义序列为5'-UUCGUAUCCAUCUGGCAGCDTDT-3'

相应的乱序siRNA用作对照(有义,5'-CUACGAUGCUGCUUAGCUCDTDT-3';反义,5'-GAGCUAAGCAGCAUCGUAGDTDT- 3')与荧光素偶联的siRNA短链用于检测裸鼠脑中抗Gal-1 siRNA的体内分布.siRNA的反义和有义链被退火

在50mmol / L Tris,pH 75至80,100mmol / L NaCl的二乙基焦碳酸酯处理水中的cturer siRNA双链体的最终浓度为100μmol/ L

乱序对照的反义和有义链以相同的方式退火人脐静脉内皮细胞用INTERFERinsiRNA转染试剂(Polyplus Transfection,Willemdorp,Belgium)按照制造商提供的说明转染

评估转染细胞中Gal-1的表达水平

在转染后第5天使用计算机辅助荧光显微镜(Olympus AX70; Omnilabo,安特卫普,比利时)配备了MegaView 2数码相机和分析软件(Soft Imaging System,Munster,德国),如前所述(21)Anti-Gal-1 siRNA管理到小鼠脑中渗透性微型泵(Alzet,Charles River Laboratories)用于以025μl/小时的载体(09%NaCl)或非病毒siRNA的速率输注在2期内输注03mg的乱序siRNA(对照)或03mg的抗Gal-1 siRNA

周,如其他地方详述(22)如Thakker等(23)所述,通过成年小鼠脑的脑室系统进行输注除了连续递送载体,对照siRNA或抗Gal-1,siRNA之外由微型泵提供;根据图1A中描述的时间表,载体,对照siRNA和siRNA也被直接注射到Hs683原位异种移植物的相同组中3次

出于伦理原因,每只在其脑中携带Hs683GBM的小鼠在二氧化碳室中进行安乐死

与肿瘤移植的第一天相比,它损失了15%的重量

将脑从颅骨中取出,在缓冲的福尔马林中固定5天,包埋在石蜡中,并切成5μm厚的切片;组织学载玻片用苏木精和曙红染色用于血管计数为了量化血管生成,如前所述,使用网格计数血管数量(21)计数的血管类型如图2A所示

在Gx200放大倍数中分析5个视野

每个肿瘤的5个载玻片中的每一个;因此,计数来自每个肿瘤25个视野 基因组和蛋白质组学分析Hs683细胞用针对Gal-1的对照或siRNA转染两次,正如我们最近关于小鼠B16F10黑素瘤细胞所详述的(21)简而言之,Hs683细胞未经处理或在16小时内用抗 - 转染Gal-1 siRNA或对照siRNA(第0天)在第1天,重复转染程序在第2天,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞,并在正常细胞培养条件下孵育

在第3天,每组合并细胞并重新接种用于后续实验

在第5,7和9天,将细胞刮入冷PBS缓冲液(用于RNA提取)或直接在沸腾裂解缓冲液(10mmol / L Tris,pH 74; 1mmol)中裂解

用抗Gal-1抗体(Preprotech TebuBio,Boechout,比利时)进行蛋白质印迹(WB)分析,得到Na / sub 3 ^ O ^ sub 4 ^ V,1%十二烷基硫酸钠,pH:74);这是针对每个实验进行的,以确认抗Gal-1 siRNA处理RNA提取的有效性,并且如在别处详述的那样评估提取的RNA的质量和完整性的确定(21)在第5天进行全基因组分析

使用Affymetrix Human Genome U133 set Plus 20(High Wycome,UK)微阵列数据分析在VIB MicroArray工厂(UZ Gasthuisberg,Leuven,Leuven,Belgium)进行转染除了R之外,还有一个开源软件环境

统计计算(24),一组称为BioConductor(25)的功能用于分析和解释基因组数据Affymetrix微阵列实验中的质量控制使用Simpleaffy包(26)进行,并与Affymetrix指南一致( Affymetrix,GeneChip Expression Analysis,2002)使用稳健多芯片分析进行背景校正,表达量化和标准化(27)为了在2个实验条件之间选择差异表达的基因,首先鉴定探针,在每个条件获得的表达值的间隔之间没有发生重叠

计算每个探针的2个实验条件之间的倍数变化(没有任何值)重叠)作为在2种不同条件下观察到的2个最接近的未记录表达值之间的比率(即,来自2种不同条件的任何2个值之间最接近1的比率)然后这些比率大于20或小于05的探针选择通过BioConductor软件包“hgu133plus2”表达分析系统资源管理软件包(版本20,版本20),从Affymetrix网站上检索候选基因的注释

28)用于收集根据微阵列分析检测为过度表达或下调的基因的生物学信息

然后使用该软件包通过特定类别中相对于所有基因的单个基因的统计过度表达来对功能基因簇进行排序

微阵列上的相同类别图1(A,B)实验方案野生型Hs683细胞在第0天(DO)原位移植(A)渗透微泵输送载体(B;实心蓝线),对照siRNA(03mg; B;实心粉红色系),或抗Gal-1 siRNA(03mg; B;实心绿线)进入第三脑室2周,载体,对照siRNA和抗Gal-1 siRNA也直接注入其中第12天(D12),第19天(D19)和第26天(D26)的组在肿瘤移植后(A;橙色箭头)每个WT中的一半小鼠,对照siRNA-和SI-转染组接受12次静脉内(尾静脉) )注射50μl盐水(纯色系; 11每组小鼠)或50μl含有替莫唑胺的溶液,以40mg / kg给药(B;阴影线;每组11只小鼠),第一次接受替莫唑胺注射后接种D5(A;蓝色箭头)(C)脑中典型的Hs683原位异种移植物(Ca)Gal-1的常规免疫组织化学(Cb-Cd)Gal-免疫荧光免疫组织化学在相同的Hs683原位异种移植物(Cc)中1(Cb,距离Ca所示的区域5mm)和SI(Cc)SI-荧光素异硫氰酸酯渗透到肿瘤中(绿色荧光)阴影白色区域描绘高siRNA浓度; 2个白色箭头表示低SI浓度的区域 (Cd)与(Cc)相同的载玻片中的半乳糖凝集素1表达(红色荧光)表示siRNA穿透区域中的特异性降低的表达,但是在低SI浓度的区域中的更高水平(D)对Gal-1表达的Western印迹分析

在WT,SCR和SI转染的Hs683细胞D,天; SCR,scrambled siRNA; SI,抗Gal-1 siRNA; WT,野生型蛋白质表达测量如前所述进行Western印迹和免疫荧光(IF)分析(6,21,22)对照实验,包括省略与一抗(阴性对照)的孵育步骤,进行等量加载通过膜的明亮的Ponceau红色染色验证了提取物的完整性和数量通过α-肌动蛋白或微管蛋白免疫印迹进行评估

使用以下原始蛋白检测作为WB和/或整个细胞进行IF分析的印迹的蛋白质

抗体:抗微血管分化基因(MDG1;稀释,1/1000; AbCam,Cambridge,UK),抗氧调节蛋白150(ORP150;稀释,1/100; IBL,Minneapolis,MN),抗VEGF(稀释,1/50; SantaCruz Tebu-Bio,Boechout,比利时),抗激活转录因子(ATF)6(稀释,1 / 500WB; 1/100 IF; Imgenex; Bio-Connect BV,Huissen,荷兰) ,抗ER跨膜激酶/核糖核酸e肌醇需要(IRE)1alpha(稀释,1/500 WB; 1/50 IF;细胞信号; Bioke,Leiden,荷兰),抗PERK(稀释,1/500 WB; 1/50 IF; Cell Signaling; Bioke),抗X盒结合蛋白1(XBP1;稀释,1/500 WB; 1 / 100 IF,Biolegend; Sanbio BV,Uden,荷兰),上游结合因子(稀释度,1/200; SantaCruz TebuBio),抗Gal-3(稀释度,1/100; Novocastra; Newcastle,UK);抗-Gal-2(稀释,1/100)和抗-Gal-9(稀释,1/100)购自R&D Systems(Abingdon,UK)

二抗购自Pierce(PerbioScience,Erembodegem,Belgium), WB和来自Molecular Probes(Invitrogen,Merelbeke,比利时)用于荧光检测(Alexafluor缀合抗体)使用Pierce超信号化学发光系统开发蛋白质印迹图2(A)Hs683原位异种移植物中的血管(Aa)血液的典型形态血管(白色箭头;苏木精和伊红染色:x 200)(Ab)SI转染,SCR转染和WT Hs683原位异种移植物中的血管计数(图1B)(B)野生型(Ba)和SCR转染( Bb)Hs683细胞在基质胶上培养时形成血管生成毛细血管网,而SI转染细胞则不生成(Bc)降低Hs683多形性胶质母细胞瘤中Gal-1表达的SI(图1D)也降低了人脐静脉中Gal-1的表达

内皮细胞(HUVE Cs)(Cd,具有Cc作为亮场控制)与SCR转染的HUVEC(Cb,Ca作为亮场控制)比较(D)尽管SI与HUVEC细胞(Cd)中的Gal-1表达降低(与WT相比) (未显示)和SCR转染的细胞(Cb),当与WT(Da)和SCR转染的HUVEC(Db)SI,抗Gal-1 siRNA相比时,它不阻止HUVEC形成毛细血管网络(Dc); SCR,对照siRNA; WT,野生型表1在人Hs683 GBM细胞中降低Gal-1表达后检测为差异表达的基因组中过量表达的基因类别通过a分析体外培养的Hs683细胞中PERX和IRE-1α的染色模式

计算机辅助荧光奥林巴斯AX70显微镜(Omnilabo)配备MegaView2数码相机和分析软件(软成像系统),如前所述(21)对于Hs683原位异种移植物中ORP150的免疫组织化学检测,肿瘤在4小时内固定24小时%甲醛,脱水和常规包埋在石蜡中在硅烷涂覆的载玻片上的5μm厚切片上进行免疫组织化学将切片与04%过氧化氢一起温育5分钟以阻断内源性过氧化物酶活性,在PBS中漂洗(004 mol / L Na ^ sub 2 ^ HPO ^ sub 4 ^,01 mol / L KH ^ sub 2 ^ PO,和012 mol / L NaCl; pH 74),并依次暴露于抗生物素蛋白20分钟(01 mg / PBS中的ml)a nd生物素(PBS中为01 mg / ml)使内源性生物素失活在PBS中冲洗后,将切片与0温育20分钟PBS中5%酪蛋白并在室温下依次暴露于1)原代特异性抗ORP150抗体(参见前面的讨论),2)生物素化的二抗(DakoCytomation,Glostrup,Denmark),和3)抗生物素蛋白 - 生物素 - 过氧化物酶复合物(ABC试剂盒; DakoCytomation)通过与含有二氨基联苯胺和H ^ sub 2 ^ O 2的染色质底物一起孵育来观察切片上标记的过氧化物酶的存在

对于对照,主要特异性抗体被省略或被非免疫抗血清取代

在所有情况下,这些对照均为阴性

使用KS400成像系统(Carl Zeiss Vision,Hallbergmoos,Germany)定量测定标记的过氧化物酶的存在

对于每个Hs683肿瘤,15个视野对应于60,000至120,000μ的总表面

扫描m ^ sup 2 ^用计算机辅助形态测定法分析ORP150的免疫组化表达,用标记指数定量表示,即百分比用ORP150抗体阳性染色的细胞转录因子活性分析用抗Gal-1 siRNA或对照siRNA将Hs683细胞转染两次,并将1组细胞与重组Gal-1(01ng / ml)一起温育24小时

第4天,将细胞刮入冷PBS缓冲液中,使用来自Active Motif的核提取试剂盒(Rixensart,Belgium;目录号40010)根据制造商的说明书使用TranSignal蛋白质/ DNA阵列进行阵列

简而言之,将生物素标记的DNA结合寡核苷酸(TranSignal探针混合物; Panomics)与15μg核提取物一起孵育以允许形成蛋白质/ DNA(或TF / DNA)复合物然后使用提供的旋转柱将蛋白质/ DNA复合物与游离探针分离

将探针与TranSignal阵列膜在42℃下杂交过夜

然后将每个膜与之一起孵育

链霉抗生物素蛋白 - 辣根过氧化物酶偶联物,用含有鲁米诺增强剂和过氧​​化物溶液的底物溶液显色,然后用Hyperfilm增强化学发光(Amersham)曝光

图3(A,B)在加扰的siRNA中处理的ORP150的免疫荧光分析(具有明视野对照)(交联后5天SCR(A)和抗γ-肌动蛋白1 siRNA处理(SI)(B)转染Hs683细胞(C)ORP150表达的蛋白质印迹分析野生型(WT),SCR或SI转染的Hs683细胞中的ssion(5,7或9天后)(D)SCR(Da) - 和SI(Db)中转染的Hs683中ORP150的免疫组织化学表达GBM(黑色箭头)(Dc)通过计算机辅助显微镜定量测定ORP150的表达(E,F)用SCR(E)中的血管内皮生长因子的明视野对照和SI(F)转染的Hs683细胞进行免疫荧光染色5天(F)中的较大染色表明细胞内的血管内皮生长因子保留

统计分析通过Kaplan-Meier曲线和Gehan广义Wilcoxon检验进行存活分析通过进行Kruskal确定对照组和治疗组之间的统计比较

-Wallis测试(非参数单向方差分析)或Mann-Whitney测试(在2组情况下)所有统计分析均使用Statistica(Statsoft,Tulsa,OK)进行

结果提供Anti-Gal-1 siRNA中的至Hs683 CBM原位异种移植物增加替莫唑胺的有益作用野生型Hs683胶质母细胞瘤细胞(未用乱序或抗Gal-1 siRNA转染)被移植到裸鼠的大脑中从第5天移植后的细胞,注入渗透性微型泵如图1A所示,载体,对照siRNA或抗Gal-1 siRNA进入小鼠,载体,对照siRNA和抗Gal-1 siRNA也在3个时间点直接注射到Hs683原位异种移植物中(图1A)小鼠还接受12次注射(每周3次,持续4周,静脉注射)50μl盐水(对照)或50μl含有相当于40mg / kg剂量的替莫唑胺的溶液;第一次注射开始于移植后第5天(图1A)替莫唑胺在所有实验组中显着增加Hs683 GBM小鼠的存活率(即野生型+载体与野生型+替莫唑胺[p图4] 5天后对照siRNA-和抗半乳糖凝集素1 siRNA-转染的Hs683细胞中微血管分化基因(MDG1)的明视野对照免疫荧光染色UBF是特异性核仁标记物MDG1与核仁中的UBF共定位以及Gal-1减少表达UBF,上游结合因子良好建立的Hs683原位异种移植物在植入后30天存在于脑中,并且在异种移植物中检测到Gal-1表达(图1Ca,Cb)抗Gal-1 siRNA-荧光素异硫氰酸酯(通过微量递送)通过绿色荧光表示的肿瘤渗透到肿瘤中(图1Cc)双重免疫染色显示,在具有高抗Gal-1 siRNA浓度的区域中Gal-1表达降低,而Gal-1表达在具有高Gal-1 siRNA浓度的区域中保持高水平

抗Gal-1 siRNA的浓度较低(图1Cd)体外转染细胞后,Hs683 GBM细胞中Gal-1表达的降低持续至少6天使用抗Gal-1 siRNA(图1D)抗Gal-1 siRNA未改变Gal-2,Gal-3或Gal-9的表达水平(数据未显示)降低Hs683中Gal-1的表达GBM细胞损伤体内血管生成和体外血管生成模拟从图1中详述的实验中收集携带异种移植物的小鼠的大脑中的肿瘤

图2Aa示出了在这些肿瘤中看到的典型血管

抗Gal-1的体内递送siRNA显着(p图5 XBP-1,ATF6,P-PERK的免疫荧光分析(具有明视野对照)和SCR(A,C,E,G)中的肌醇需要(IRE)1alpha - 或SI(B) ,D,F,H) - 转染(5天后)Hs683细胞Phospho-PERK(I)和IRE-1alpha(I)免疫荧光染色表达通过计算机辅助显微镜定量测定(J)IRE的Western印迹分析在Hs683细胞中4或5天后转染的野生型(Wt),SCR或SI中的-1alpha表达(上样对照;微管蛋白)ATF,激活转录因子; P-PERK,磷酸化蛋白激酶样内质网激酶; SCR,对照siRNA; SI,抗半乳糖凝集素1 siRNA XBP-1,X-box结合蛋白侵袭性肿瘤,包括恶性黑色素瘤和胶质瘤,可能会形成肿瘤细胞,形成血管通道,促进肿瘤灌注而不依赖于肿瘤血管生成(29,30)因为缺氧影响血管生成,血管生成模拟通道形成(即体外毛细血管样网络的产生)和肿瘤侵袭相关蛋白在黑色素瘤中的表达(31),我们研究了Hs683 GBM细胞是否能够在体外进行血管生成拟态样过程

野生型(图2Ba)和对照转染(图2Bb)Hs683 GBM细胞在Matrigel上培养,它们产生血管生成拟态的联网过程,而抗Gal-1 siRNA转染的Hs683细胞则没有(图2Bc)正常的HUVEC表达高水平的Gal-1(图2Ca,Cb),显着降低了大约70%的这些细胞中的Gal-1表达(图2Cc,Cd),没有损害它们形成毛细血管网的能力

s(图2Dc)与野生型(图2Da)或对照转染的HUVEC(图2Db)比较这些结果在3个不同批次的HUVEC中复制(数据未显示)因此,减少Gal的抗血管生成作用Hs683肿瘤中的-1表达似乎对肿瘤血管生成相对特异

图6根据引用的参考文献描述的UPRE-和/或ER应激元件(ERSE)序列依赖性基因表达的内质网(ER)应激相关控制(表2)ATF,激活转录因子; Bip / CRP78:免疫球蛋白重链结合蛋白/葡萄糖调节蛋白,78kd; elF2,真核起始因子2; GADD,生长停滞和DNA损伤; HERP,同型半胱氨酸诱导的ER应激诱导蛋白; Hsp70,70-kDa热休克蛋白; IRE,肌醇需要; NF-Y,核转录因子Y; ORP150,150-kDa氧相关蛋白; PDIA4,蛋白质disuifide异构酶相关4; PERK,蛋白激酶样ER激酶; U-Pr,未折叠的蛋白质; UPRE,展开的蛋白质反应元素; XBP-1,X-box结合蛋白降低Hs683 GBM细胞中Gal-1的表达损害ER应激反应Hs683细胞,其中通过抗Gal-1 siRNA转染减少Gal-1表达,进行微阵列分析100发现三十三个基因过表达超过200%(“表达水平”> 2表1中的0或降低超过50%(Hs683 GBM细胞中的“表达水平”瞬时Cal-1减少通过VEGF的保留减少MDG1和ORP150表达并损害血管生成在表1中的基因列表中,ORP150和已知MDG1在血管生成中起主要作用氧调节蛋白150是一种可诱导的ER伴侣,通过VEGF的加工在肿瘤介导的血管生成中起主要作用

(32)首先从培养的星形胶质细胞中鉴定和克隆氧调节蛋白150基于它们抵抗甚至产生神经营养因子以应对严重缺氧的能力(33)我们首先通过IF验证了ORP150的基因表达谱分析结果(图3A,B)和WB(图3C)我们进一步验证了我们的体外(图3A-C)通过肿瘤样品的免疫组织化学染色的数据显着地体内递送抗Gal-1 siRNA(p表2靶向基因的转录因子的鉴定*表达血管生成因子如VEGF在细胞应激条件下涉及转录和翻译事件以及诱导型ER伴侣蛋白的重要作用(32,33)C6大鼠胶质瘤中ORP150表达的体内减少诱导C6胶质瘤血管生成减少,体外抑制ORP150表达减少VEGF释放到C6培养的肿瘤细胞上清液中(32)在ORP150反义转染C6大鼠胶质瘤细胞中,VEGF在ER内积累(32)ORP150水平升高促进VEGF加工随后从ER转移到高尔基体,然后从细胞分泌(34)ORP150反义C6转染子引起的肿瘤细胞死亡机制主要来自血管生成的抑制,血管生成是由VEGF的保留引起的

ER(32)在本研究中,Hs683 GBM细胞中Gal-1表达的减少导致VEGF分泌减少到培养基中(数据n与对照siRNA转染的(图3E)Hs683细胞相比,抗Gal-1 siRNA转染(图3F)显着积累这可能导致体内血管生成受损(图2Ab)两种mRNA(表1) )和MDG1的细胞表达(图4)(DNAJB9;在具有减少的Gal-1表达的Hs683GBM细胞中Erdj4)显着降低高水平的MDG1基因表达反映了内皮细胞的活化状态(35),并且其在内皮细胞中的上调由ER应激诱导(36)使用由上游结合因子(UBF)作为核仁标记物(37)微血管分化基因也可能在稳定78-kd葡萄糖调节蛋白(GRP78)与未折叠基质蛋白以J域依赖性方式的作用中发挥多种作用,从而防止ER中未折叠蛋白的积累,从而保护细胞免受ER应激(36)当Hs683细胞中Gal-1表达降低时,GRP78的mRNA水平降低4倍以上(表1)微血管分化基因为最初从I型胶原蛋白(3D培养)中培养的分化微血管内皮细胞中分离出来,并且已知在受到变异的情况下在原代内皮细胞和系膜细胞中被上调

应激刺激(36)微血管分化基因蛋白在对照条件下位于细胞质中,但应激诱导它们易位到细胞核中,并在细胞核中积累(36)同样,Hs683 GBM细胞中Gal-1的瞬时减少引起细胞质MDG1表达减少,同时在核仁中积累(图4)Gal-1可能通过IRE-1α调节ORP150表达Hs683细胞中Galectin 1的表达没有改变XBP-1的表达水平(图5A,B),ATF6(图5C,D)或RNA依赖性PERK(图5E,F)相反,降低Gal-1表达伴随着IRE-1α表达的显着降低(图5G,I; p已经确定了图5中分析的靶标和它们所涉及的信号通路的清晰关系(图6)需要肌醇的1alpha在mRNA剪接过程中起主要作用,即Gal-1参与的细胞过程

(见讨论部分)表3 缺氧相关基因(除了ORP150和MDG1)参与血管生成,其在抗-Galctin 1 siRNA-处理的Hs683 GBM细胞中被修饰的mRNA表达水平ORP150基因中证实的ER应激反应元件(ERSE)序列是也存在于其他基因的启动子中,包括例如GRP78和同型半胱氨酸诱导的ER应激诱导蛋白(图6)这些蛋白质的每个基因的表达在转染的抗Gal-1 siRNA中也被下调

Hs683细胞(表1)表2概述了潜在的Gal-1靶向基因(表1),其启动子含有由参与ER应激和/或UPR的转录因子靶向的序列(图6)

简言之,表2中的数据表明,降低Hs683 GBM细胞中Gal-1的表达会诱导一系列基因的mRNA水平降低,这些基因直接参与ER应激和/或UPR,其启动子被激活

ERSE或ERSE-relat靶向转录因子减少Gal-1表达减少与血管生成有关的缺氧相关基因的mRNA知道缺氧刺激Gal-1表达(13)并且Gal-1是一种有效的促血管生成因子(9),具有重要影响在基因表达(表1)和蛋白质(图3,4)水平的MDG1和ORP150上,研究了其表达在Gal-1敲低时被修饰的133个基因的列表,用于已知缺氧调节并涉及血管生成的那些基因

图3显示,当Gal-1表达减少时,6个与血管生成有关的缺氧相关基因(CTGF,ATF3,PPP1R15A,HSPA5,TRA1和CYR61)(除ORP150和MDG1外)在Hs683细胞中mRNA水平降低Galectin 1因此,似乎是缺氧介导的修饰在几个与血管生成有关的基因表达中的关键效应

讨论缺氧刺激Gal-1表达(13)并激活UPR(54,55)缺氧也支持通过调节mRNA翻译的起始步骤来调节蛋白质合成(17)本研究表明,通过调节肿瘤细胞防御的一般机制,Gal-1可以成为这些过程中的关键介质因为Gal-1本身是由缺氧刺激的

至少在人类Hs683 GBM和小鼠B16F10黑色素瘤(23)模型中似乎就是这种情况.Gal-1在癌细胞中的保护作用似乎至少部分与群集表达的控制有关

已知参与血管生成的缺氧相关基因包括ORP150半乳糖凝集素1因此可通过激活IRE-1α控制ORP150表达,从而控制VEGF成熟(图5,6)Gal-1和IRE-1alpha均为与mRNA剪接有关的培养的星形胶质细胞暴露于低氧应激过度表达GRP78 / Bip,GRP94和ORP150(56)此外,这3种蛋白质在ER中的定位(57)表明缺氧会引起应激反应

可能在该细胞器中的校正点(56)降低Gal-1表达,甚至是短暂的,显着降低GRP78 / Bip,GRP94和ORP150以及许多其他缺氧相关基因(表1-3)的表达水平

Hs683细胞氧调节蛋白150可能通过减少ER应激和抑制细胞凋亡(60)对人(58)和啮齿动物脑(59)以及肾小管上皮(60)的缺血/再灌注损伤具有细胞保护作用

)如在本研究中,抑制培养的巨噬细胞中的ORP150表达导致VEGF在ER内的保留,而ORP150的过表达促进VEGF分泌到缺氧培养上清液中(32,34)ORP150水平的增加促进VEGF加工随后的运输从ER到高尔基体,然后输出细胞(32,34)降低Hs683细胞中Gal-1的表达显着降低ORP150的表达,并导致VEGF在Hs683细胞中的积累(图3)在哺乳动物细胞中,有4个传感器对ER应激有反应:IRE-1alpha,IRE-1beta,PERK和ATF6(34,61)(图6)蛋白激酶样ER激酶在翻译衰减中起重要作用

通过激活ATF4,GADD 153和CCAAT /增强子结合蛋白同源蛋白控制的途径,在ER应激过程中发生凋亡和凋亡(61) 本研究表明,在Hs683细胞中瞬时降低Gal-1不会改变PERK(基因组或蛋白质组水平)或基因组水平ATF4的表达(数据未显示)它也不会诱导这些细胞凋亡

(数据未显示)据报道,需要肌醇的1β参与rRNA的ER应激依赖性降解(61,62)

本研究表明,短暂降低Gal-1不会改变基因组或IRE-1β表达

HS683细胞中的蛋白质组水平(数据未显示)需要肌醇的1α和ATF6在ER伴侣蛋白的诱导中发挥重要作用激活转录因子6是在N末端含有DNA结合结构域的90kd II型ER跨膜蛋白

细胞质区域,而其C末端结构域位于ER腔内(61)在ER应激刺激下,ATF6被位点1和位点2蛋白酶切割,相同的酶切割甾醇应答元件结合蛋白(44)T将50-kd N-末端一半的蛋白质转运至细胞核并识别ER伴侣蛋白基因启动子中的ERSE(共有序列CCAATN ^ sub 9 ^ C-CACG),包括GRP78,GRP94,ORP150,同型半胱氨酸诱导蛋白

ER应激诱导蛋白和PDIA4 / ERP70(图6;表2)所有这些基因的这些表达水平通过瞬时降低Gal-1表达而被修饰激活转录因子6仅在存在核因子Y的情况下结合ERSE,核因子Y识别CCAAT盒(61)(图6)内质网应激激活的ATF6通过XBP1基因的ERSE元件诱导XBP1 mRNA的转录(61)在Hs683细胞中瞬时减少Gal-1不会在基因组或蛋白质组水平上改变XBP1表达,也不会在转录组水平上改变其活性(数据不是在ER应激条件下,X-box结合蛋白1 mRNA被IRE-1alpha蛋白剪接(61)从剪接mRNA翻译的XBP1蛋白对转录有活性,而从未剪接mRNA转化的XBP1蛋白无活性且迅速降解(61)活性XBP1在核因子Y存在下识别ERSE并激活XBP1基因本身和ER伴侣蛋白的转录(44)目前的数据显示减少在Hs683细胞中瞬时加入Gal-1显着改变了这些细胞中IRE-1α的表达水平(图5),从而阻止了XBP1剪接Gal-1可能在前mRNA剪接中发挥作用的初步暗示来自于核HeLa细胞的提取物含有Gal-1和Gal-3,并且通过乳糖亲和吸附或通过双抗体吸附从这些核提取物中消耗两种Gals导致剪接活性的丧失(63,64)此外, Gal-1和Gal-3通过双IF实验显示在核斑点中共定位,具有已知的剪接因子,例如携带Sm表位的小核核糖核蛋白的核心多肽和小核核糖核蛋白剪接因子SC35

此外,它是在双杂交筛选中显示,Gal-1直接与Gemin4结合,Gemin4是含有运动神经元蛋白存活的核复合物的组分(63)

还显示Gal-1和Gal-3共免疫沉淀的抗血清

e与蛋白质因子,包括HnRNP C1 / C2和Slu7,它们是剪接体复合物的组成部分(65)本研究中强调的ER应激反应中Gal-1相关功能的新方面可能适用于治疗通过体内递送如本文所证明的抗Gal-1 siRNA或通过抑制Gal-1表达和/或生物活性的化学物质进行操作(7,8,66,67)抗-Gal-1 siRNA的体内递送可以在使用Ommaya储库的GBMs中直接进行,从而最大限度地减少/避免全身释放/暴露和潜在的肝毒性因此降低胶质瘤中Gal-1表达水平可能因此i)有助于降低扩散侵入大脑的个体GBM细胞的迁移水平薄壁组织(6,7;图2Bc); ii)通过降低其对ER应激和/或UPR的反应能力来削弱神经胶质瘤细胞防御;和iii)损害血管生成在本研究中共同观察到这些效应,以增强自体药物替莫唑胺的治疗益处,替莫唑胺,GBM患者的当前标准化学治疗,体内胶质母细胞瘤模型 本研究未显示对替莫唑胺对Gal-1敲低的明显改善的直接原因和影响我们的观察结果可能与Gal-1敲低介导的对缺氧/血管生成和应激基因的影响一致,或者与这些基因涉及可能解释对替莫唑胺的改善反应的途径我们正在进行实验以进一步阐明Gal-1敲低增强替莫唑胺在实验性神经胶质瘤模型中的治疗益处的机制参考文献1 Lefranc F,Brotchi J, Kiss R治疗胶质母细胞瘤的未来可能的问题:特别强调细胞迁移和迁移性胶质母细胞瘤细胞对细胞凋亡的抵抗J Clin Oncol 2005; 23:2411-22 2 Lefranc F,Sadeghi N,Camby I,et al现在和潜在的胶质母细胞瘤治疗的未来问题Expert Rev Anticancer Ther 2006; 6:719-32 3 Rong Y,Durden DL,Van Meir EG,et al'Pseudopalisading'necrosis in胶质母细胞瘤:一种熟悉的形态学特征,与血管病理学,缺氧和血管生成有关J Neuropathol Exp Neurol 2006; 65:529-39 4 Liu FT,Rabinovich GA Galectins as肿瘤进展调节剂Nat Rev Cancer 2005; 5:29-41 5 Camby I,Le Mercier M,Lefranc F,等人Galectin-1:具有主要功能的小蛋白质Glycobiology 2006; 16:137R-57R 6 Camby I,Belot N,Lefranc F,等人Galectin-1调节人胶质母细胞瘤细胞迁移到大脑通过对肌动蛋白细胞骨架的修饰和小GTP酶的表达水平J Neuropathol Exp Neurol 2002; 61:585-96 7 Camby I,Belot N,Rorive S,等人Galectins在幕上毛细胞瘤,星形细胞瘤,间变性中差异表达星形细胞瘤和胶质母细胞瘤,并显着调节肿瘤星形胶质细胞迁移Brain Pathol 2001; 11:12-26 8 Baum LG,Seilhamer JJ,Pang M,等人内皮细胞合成内源性凝集素galectin-1受上调内皮细胞活化Glycoconj J 1995; 12:63-68 9 Thijssen VL,Postel R,Brandwijk RJ,等人Galectin-1在肿瘤血管生成中是必需的,并且是抗血管生成治疗的靶标Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:15975-80 10 Thijssen VL,Poirier F,Baum LG,et al Galectins in the tumor endothelium:Opportunities for combined cancer therapy Blood 2007; 110:2819-27 11 Perillo NL,Pace KE,Seilhamer JJ,等,凋亡的T细胞由galectin-1 Nature 1995; 378:736-39 12 Rabinovich GA,Gabrilovich D,Sotomayor EM免疫抑制策略由肿瘤介导细胞Annu Rev Immunol 2007; 25:267-96 13 Le QT,Shi G,Cao H,et al Galectin-1:肿瘤缺氧与肿瘤免疫特权之间的联系J Clin Oncol 2005; 23:8932-41 14 Keith B, Simon MC缺氧诱导因子,干细胞和癌症Cell 2007; 129:465-72 15 Kim JW,Gao P,Dang CV缺氧对肿瘤代谢的影响Cancer Metastasis Rev 2007; 26:291-98 16 Magagnin MG,Koritzinsky M,Wouters BG肿瘤氧合模式及其对细胞缺氧反应和缺氧定向治疗的影响Drug Resist Updat 2006; 9:185-97 17 van den Beucken T,Koritzinsky M,Wouters BG缺氧期间基因表达的翻译控制Biol Ther 2006; 5:749-55 18 Koumenis C ER应激,缺氧耐受和肿瘤进展Curr Mol Med 2006; 6:55-69 1 9 Pouyssegur J,Dayan F,Mazure NM癌症中的缺氧信号传导和实施肿瘤消退的方法Nature 2006; 441:437-43 20 Branle F,Lefranc F,Camby 1,et al评估化疗在体内原位模型中的效率具有和不具有1p19q缺失的人神经胶质瘤细胞和用于评估手术并结合化疗的C6大鼠原位同种异体移植物的研究癌症2002; 95:641-55 21 Mathieu V,Le Mercier M,De Neve N,等人Galectin-1 knockdown在B16F10小鼠转移性黑色素瘤模型中增加对替莫唑胺的敏感性J Invest Dermatol 2007; 127:2399-2410 22 Lefranc F,Sadeghi N,Metens T,Brotchi J,Salmon I,Kiss R胃泌素诱导的细胞抑制对细胞增殖的影响的表征实验性神经胶质瘤Neurosurgery 2003; 52:881-90 23 Thakker DR,Natt F,Husken D,等人通过使用非病毒RNA干扰在成年小鼠脑中广泛基因敲除的神经化学和行为后果Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:17270-75 24发展核心团队2006 R:统计计算的语言和环境 奥地利维也纳:R统计计算基金会25 Gentleman RC,Carey VJ,Bates DM,等人Bioconductor:计算生物学和生物信息学开放软件开发Genome Biol 2004; 5:R80 26 Wilson CL,Miller CJ Simpleaffy:BioConductor包Affymetrix质量控制和数据分析Bioinformatics 2005; 21:3683-85 27 Bolstad BM,Irizarry RA,Astrand M,et al基于方差和偏差的高密度寡核苷酸阵列数据归一化方法的比较Bioinformatics 2003; 19:185-93 28 Hosack DA,Dennis G Jr,Sherman BT等,轻松识别基因列表中的生物学主题Genome Biol 2003; 4:R70 29 Hendrix MJ,Seftor EA,Hess AR,et al Vasculogenic mimicry and tumor-cell plasticity:Lessons来自黑色素瘤Nat Rev Cancer 2003; 3:411-21 30 Yue WY,Chen ZP星形细胞瘤中是否存在血管生成拟态

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